配偶者と別居中です。自宅に残した荷物を、自宅に勝手に入って持ち出してよいですか。

勝手に持ち出すのは避けた方がよいでしょう。自宅を出て別居状態である場合、建物については配偶者が事実上管理しているので、勝手に入ることは違法とされる（住居侵入罪に問われる）可能性が高いといえます。
対応としては、例えば、次のようなものが考えられます。

・配偶者の同意を得た上で、配偶者または第三者の立会いのもとで行う（相手方に代理人弁護士がついているケースでは、まずは代理人弁護士に連絡をとる）
・話合いがうまくいかなかった場合には、夫婦関係調整調停（円満・離婚）を申し立て、調停委員に自分の要望を伝えて、調整をお願いする